藥典2015版光譜法

0400 光譜法

光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁福射作用時，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。按不同的分類方式，光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動、轉(zhuǎn)動光譜，電子自旋及核自旋譜等。 質(zhì)譜法（mass spectrometry，MS）是在離子源中將分子解離成氣態(tài)離子，測定生成離子的質(zhì)量和強度（質(zhì)譜），進行定性和定量分析的一種常用譜學(xué)分析方法。嚴格地講，質(zhì)譜法不屬于光譜法范疇，但基于其譜圖表達的特征性與光譜法類似，故通常將其與光譜法歸為一類。 分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。常用的技術(shù)包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等?？梢姽鈪^(qū)的分光光度法在早期被稱為比色法。 光散射法是測量由于溶液亞微觀的光學(xué)密度不均一產(chǎn)生的散射光，這種方法在測量具有1000到數(shù)億分子量的多分散體系的平均分子量方面有重要作用。拉曼光譜法是一種非彈性光散射法，是指被測樣品在強烈的單色光（通常是激光）照射下光發(fā)生散射時，分析被測樣品發(fā)出的散射光頻率位移的方法。上述這些方法所用的波長范圍包括從紫外光區(qū)至紅外光區(qū)。為了敘述方便，光譜范圍大致分成紫外區(qū)（190～400nm），可見區(qū)（400～760nm），近紅外區(qū)（760～2500nm），紅外區(qū)（2.5～40μm或4000～250cm^-1）。所用儀器為紫外分光光度計、可見分光光度計（或比色計）、近紅外分光光度計、紅外分光光度計、熒光分光光度計或原子吸收分光光度計，以及光散射計和拉曼光譜儀。為保證測量的精密度和準(zhǔn)確度，所用儀器應(yīng)按照國家計量檢定規(guī)程或藥典通則中各光譜法的相應(yīng)規(guī)定，定期進行校正檢定。 原理和術(shù)語 單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表述如下： A=1g（1/T）= Ecl 式中 A為吸光度； T為透光率； E為吸收系數(shù)，常用的表示方法（），其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時的吸光度數(shù)值； c為100ml溶液中所含物質(zhì)的重量（按干燥品或無水物計算），g； l為液層厚度，cm。 上述公式中吸收系數(shù)也可以摩爾吸收系數(shù)ε來表示，其物理意義為溶液濃度c為1mol/L和液層厚度為1cm時的吸光度數(shù)值。在大吸收波長處摩爾吸收系數(shù)表示為εmax。 物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。在一定條件下，物質(zhì)的吸收系數(shù)是恒定的，且與入射光的強度、吸收池厚度及樣品濃度無關(guān)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定，故又稱之為比色分析。 化學(xué)因素或儀器變化可引起朗伯-比爾定律的偏離。由于溶質(zhì)間或溶質(zhì)與溶劑的締合及溶質(zhì)解離等引起溶質(zhì)濃度改變，將產(chǎn)生明顯的朗伯-比爾定律偏離。非單色入射光、狹縫寬度效應(yīng)和雜散光等儀器因素都會造成朗伯-比爾定律的偏離。 原子吸收過程基本上遵從朗伯-比爾定律，吸光度與待測元素的原子數(shù)目呈正比關(guān)系。據(jù)此，可建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)溶液的吸收值計算溶液中元素的濃度。 熒光發(fā)射光譜是經(jīng)光照射的活性物質(zhì)的發(fā)射光分布光譜圖，它以被激發(fā)物質(zhì)發(fā)射光的強度為縱坐標(biāo)，以發(fā)射光的波長為橫坐標(biāo)。熒光激發(fā)光譜是激發(fā)光分布光譜圖，它以被激發(fā)物質(zhì)發(fā)射光的強度為縱坐標(biāo)，以入射（激發(fā)）光波長為橫坐標(biāo)。如同在吸收光譜中一樣，有機化合物熒光所覆蓋的電磁波光譜重要的區(qū)域包括紫外區(qū)、可見區(qū)和近紅外區(qū)等，在250～800nm范圍。當(dāng)分子吸收光輻射后，能量以熱能的方式消散或以與吸收波長相同或更長的光輻射釋放。光的吸收和發(fā)射都是由于電子在分子不同能級間、不同軌道間發(fā)生躍遷造成的。在光的吸收和發(fā)射間存在時間延遲，對于大多數(shù)有機熒光化合物溶液，這一時間間隔也就是分子位于激發(fā)態(tài)的時間，大約為10^-9～10^-8秒。熒光的壽命很短，可與磷光相區(qū)別，后者的壽命一般為10^-3秒到幾分鐘。 拉曼散射活性是一種分子特性（單位cm⁴/g），它決定隨機取向樣品中所觀察的拉曼譜帶強度。拉曼散射活性由產(chǎn)生的分子極化所決定，極化使分子運動而產(chǎn)生拉曼位移譜帶。一般，拉曼譜帶的強度與樣品的濃度呈正比關(guān)系。 當(dāng)各論正文品種中給出紅外光譜或拉曼光譜數(shù)據(jù)時，字母S、M、W分別代表強峰、中等強度峰和弱峰；sh為肩峰，bd為寬峰，v表示非常的意思。 各光譜法相對適用性 對于多數(shù)藥物，紫外-可見光譜法定量測量的準(zhǔn)確度和靈敏度要比近紅外和紅外光譜法高。物質(zhì)的紫外-可見光譜通常專屬性差，但是很適合作定量分析，對于大多數(shù)物質(zhì)也是有用的輔助鑒別方法。近年來，近紅外光譜法的應(yīng)用日益廣泛，特別是在大量樣品的快速鑒別和水分測定方面。近紅外光譜特別適合測定羥基和氨基，例如乙醇中的水分，氨基存在時的羥基，碳氫化合物中的乙醇，以及叔胺存在時的伯胺和仲胺等。 在不含光學(xué)異構(gòu)體的情況下，任何一個化合物都有一個特定紅外光譜，光學(xué)異構(gòu)體具有相同的紅外光譜。但是，某些化合物在固態(tài)時會表現(xiàn)出多晶型，多晶型會導(dǎo)致紅外光譜的差異。通常，結(jié)構(gòu)中微小的差別會使紅外光譜有很明顯的差別。在紅外光譜中呈現(xiàn)大量的吸收峰，有時不需進行預(yù)先分離，也可以定量測定成分已知的混合物中的某個特定成分。 拉曼和紅外光譜對于不同的官能團具有不同的相對靈敏度，例如，拉曼光譜對碳硫鍵和碳碳鍵特別靈敏，更容易鑒別某些芳香化合物。水有很強的紅外吸收但其拉曼散射卻特別弱。因此，拉曼光譜幾乎不受水的影響，對含水物的鑒別很有用。拉曼光譜有兩個主要不足：一是低檢測濃度通常為10^-1～10^-2mol/L，二是許多物質(zhì)中的雜質(zhì)會發(fā)出熒光干擾拉曼散射信號的檢測。 光反射測量法提供的紅外光譜信息與發(fā)射光測量法的相似。由于光反射測量法僅探測樣品的表面成分，克服了與光學(xué)厚度和物質(zhì)散射性相關(guān)的困難。因此，反射測量用于強吸收物質(zhì)的檢測更容易。一種常用于紅外反射光檢測的特殊技術(shù)被稱為衰減全反射（ATR），也被稱為多重內(nèi)反射（MIR））。 ATR技術(shù)的靈敏度很高，但重現(xiàn)性較差，不是一個可靠的定量技術(shù)，除非每個待測成分都有合適的內(nèi)標(biāo)。 熒光分光光度法比紫外分光光度法的靈敏度高。在熒光光譜中，空白溶液的信號很低，以致由背景發(fā)射產(chǎn)生的干擾要小得多。通常，濃度低于10^-5mol/L的化合物幾乎不能用吸收光譜測定，而熒光光譜的測定濃度可以低至10^-7～10^-8mol/L。 對照品的使用 在鑒別、檢查和定量測定中，使用對照品進行比較時，應(yīng)保證供試品和對照品在相同的條件下進行測量。這些條件包括波長的設(shè)定，狹縫寬度的調(diào)整，吸收池的位置和校正以及透光率水平。吸收池在不同波長下透光率可能會有差異，必要時，應(yīng)對吸收池進行多波長點的校正。 “同法制備”、“相同溶液”等描述，實際上是指對照樣品（通常是對照品）和供試樣品應(yīng)同法制備，同法檢測。在制備對照品溶液時，制備的溶液濃度（例如10%以內(nèi)）只是期望濃度的近似值，而吸光度的計算則以的稱量為基礎(chǔ)；如果沒有使用預(yù)先干燥的對照品，吸光度則應(yīng)按無水物計算。 “同時測定”、“同時測量”等描述，是指特定空白溶液的吸光度、對照品溶液的吸光度和供試品溶液的吸光度應(yīng)立即依序測定。