Cassification
紅花為菊科植物紅花 (CarthamustinctoriusL.)的管狀花,為活血化淤中藥 ,常用于血脈閉塞 、跌打損傷 、瘡瘍腫痛等?,F(xiàn)代研究表明,紅花中含黃酮類化合物、酚酸、脂肪酸與揮發(fā)油等成分,其主要藥理作用包括抗凝血和血栓形成,對心肌的保護作用,降血壓、血脂作用,抗氧化作用,對神經(jīng)系統(tǒng) 的保護作用等。因此,紅花越來越引起醫(yī)藥和食品研發(fā)工作者的廣泛關(guān)注。黃酮類化合物具有多種功效(如抗自由基、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、抗菌及抗病毒活性等)。
本實驗利用乙醇為提取試劑,通過實驗從蘆丁和槲皮素中選擇標準品,通過紫外可見分光光度計的光譜掃描功能來確定紅花黃酮類化合物的分光光度法實驗標準品及實驗波長。
1、實驗準備
實驗材料及試劑: 紅花、蘆丁、槲皮素,無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁均為分析純 。
實驗儀器:UV-5200紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司)
低速離心機
2、實驗過程
1、標準品配置
1)0.1mg/mL蘆丁標準溶液配制:精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品50mg于500mL容量瓶中,加30%vol乙醇15mL,于30℃水浴鍋中加熱,使之溶解,放冷,以30%vol乙醇定容,搖勻。
2)0.1mg/mL槲皮素標準溶液的配制:精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品50mg于500mL容量瓶中,加30%vol乙醇15mL使之溶解,用30%vol乙醇溶解定容至刻度,搖勻。
2、樣品制備
1)紅花黃酮粗提取液制備:原料清理、干燥、粉碎,過40目篩,備用。取一定量紅花粉狀物,加入65%vol乙醇,料液比1:20,30℃充分浸泡20min,置于50%水浴振蕩器中,振蕩提取2h,過濾,離心取上清液,定容。
2)紅花黃酮純化液制備:取一定量紅花黃酮粗提取液,以lmL/min的吸附流速過AB-8大孔樹脂柱,至吸附飽和。先用蒸餾水洗去雜質(zhì),再用65%vol乙醇以lmL/min的洗脫流速洗脫,至洗脫*。
3、直接測定法
移取紅花黃酮粗提取液、紅花黃酮純化液,蘆丁和槲皮素溶液各lmL于10mL具塞試管中,用30%vol乙醇定容,搖勻,在波長200nm-600nm處進行掃描,記錄光譜,如圖A所示。
4、硝酸鋁顯色法
分別取紅花黃酮提取液、紅花黃酮純化液、蘆丁和槲皮素對照品溶液各3mL于3支25mL容量瓶中,各加入30%vol乙醇至10mL,加入5%亞硝酸鈉lmL,搖勻,放置5min,然后又加入10%硝酸鋁lmL,搖勻,放置6min,再加入4%氫氧化鈉10mL,用30%vol乙醇定容,搖勻,放置10min后,進行掃描以不加樣為空白。在波長200nm-600nm處進行掃描,記錄光譜,如圖B所示。
5、氯化鋁顯色法
移取紅花黃酮粗提取液、紅花黃酮純化液、蘆丁和槲皮素溶液各lmL于10mL具塞試管中,加入lmL1%三氯化鋁(乙醇液),用30%vol乙醇定容,搖勻,放置10min。以不加樣品為空白,在波長200nm-600nm處進行掃描,記錄光譜,如圖C所示
1.蘆丁標準液 2.槲皮素標準液 3.紅花黃酮純化液 4.紅花黃酮粗提
3、實驗結(jié)果分析
試驗分別對紅花黃酮粗提取液、紅花黃酮純化液、蘆丁標準液及槲皮素標準液采用不同顯色反應(yīng)后,在波長200nm~600nm處進行波長掃描,結(jié)果見圖A、B、C。
從圖A可以看出,在波長200nm~400nm處,蘆丁與槲皮素均存在2個主要的紫外吸收帶,即蘆丁在波長267nm和363nm處有明顯吸收峰、槲皮素在波長256nm和374nm處有明顯吸收峰。紅花黃酮粗提液與紅花黃酮純化液在波長332nm處有明顯吸收峰??梢?,蘆丁和槲皮素的吸收峰位置與紅花黃酮的吸收峰位置吻合性較差,故不能采取直接法測定紅花黃酮含量。
圖B是硝酸鋁顯色法的測定結(jié)果,也是目前常用的測定黃酮的方法。由圖B發(fā)現(xiàn),蘆丁加硝酸鋁顯色后在波長510nm處有明顯紫外吸收峰,槲皮素和紅花中的主要黃酮類化合物在該法常用的波長510nm處均無明顯吸收峰,說明紅花中的黃酮物質(zhì)不具有該顯色法所要求的化學基團。因此,槲皮素和蘆丁此時均不能選為標準品,同時也可說明,硝酸鋁法并不適合紅花中黃酮含量的測定。
從圖C可以看出,紅花黃酮粗提液、紅花黃酮純化液、蘆丁與槲皮素在波長400nm~450nm處都有明顯的吸收峰,吻合性較好,且吸收鋒位置基本一致。在波長400nm~450nm處,蘆丁的紫外吸收峰在波長422nm處,槲皮素在波長436nm處,紅花黃酮純化液與紅花黃酮粗提液均在波長406nm處。由此可見,蘆丁和紅花黃酮的吸收峰位置更相近,并且蘆丁易得且價格相對更低。因此,試驗選擇以蘆丁為標準品,測定波長為406nm作為測定方法。用蘆丁作為標準品繪制標準曲線,分別精密吸取蘆丁標準液0mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL與2.2mL,再各加入1.0mL1%三氯化鋁,用30%vol乙醇定容至10mL,放置l0min后,在波長406nm處測定吸光度值,并建立回歸方程:y=33.673x+0.0046, R2=0.99974、結(jié)論
采用上海元析儀器有限公司的UV-5200紫外-可見分光光度計對紅花中黃酮類化合物在200nm~600nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描實驗,實驗結(jié)果表明可采用氯化鋁顯色法,選擇蘆丁作為標準品,406nm作為特征波長進行實驗,*測定紅花黃酮類化合物的日常實驗要求。
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